蛋白樣品制備中各類雜質(zhì)和雜蛋白的去除

蛋白樣品制備中，在細(xì)胞破碎之后，既可以利用特定蛋白質(zhì)的特性來(lái)分離某一類蛋白質(zhì)，比如親和純化，比如前面介紹的磷酸化蛋白富集，或者膜蛋白富集；另外一個(gè)考慮方向是去除雜質(zhì)----去掉樣品中某些非目標(biāo)高豐度蛋白或者雜質(zhì)的干擾，同樣可以達(dá)到簡(jiǎn)化樣本的目的。當(dāng)然要小心“倒洗腳水的時(shí)候別把嬰兒也倒掉了”，一定要選擇可靠的產(chǎn)品。

比如，潛在疾病標(biāo)志物的樣本來(lái)源就是血清或其他體液，此類樣本可以提供人蛋白質(zhì)組中絕大部分組份。然而用蛋白質(zhì)組分析方法鑒定疾病標(biāo)志物zui大的挑戰(zhàn)來(lái)自于血清中大量的高豐度蛋白對(duì)檢測(cè)的干擾，血清中有大約55%的蛋白為白蛋白，而IgG大約占血清中蛋白總量的10-25%，這些高豐度蛋白的存在會(huì)增加低豐度蛋白檢測(cè)的難度，去除占血清總蛋白近75%的白蛋白和IgG將有助于更好地鑒定其他的蛋白。G-Biosciences的AlbuminOUT™白蛋白去除試劑盒堪稱白蛋白去除神器。血漿和腦脊髓液等樣本中，包含大量的白蛋白，從而封閉掉在二維凝膠電泳中發(fā)現(xiàn)和鑒定其他低豐度蛋白的可能。AlbuminOUT™白蛋白去除試劑盒被設(shè)計(jì)用來(lái)在這種樣本中大量去除白蛋白。

這種白蛋白去除方法是基于白蛋白和Cibachron藍(lán)色染料的結(jié)合。AlbuminOUT™被優(yōu)化從樣本中去除人的白蛋白。AlbuminOUT™使用快速離心柱方法，每個(gè)柱子含有0.2ml的染料結(jié)合樹(shù)脂，從而可以結(jié)合大于2mg的人白蛋白。AlbuminOUT™可以從5-50微升人血漿中去除大于98%的白蛋白。

離心柱形式可以在10分鐘內(nèi)去除白蛋白。高結(jié)合力的藍(lán)色染料結(jié)合樹(shù)脂可以從人，豬，羊，狗，兔，大鼠和牛樣本中達(dá)到瞬間的結(jié)合和去除白蛋白。AlbuminOUT™或許也可以從其他物種中去除白蛋白。適用于處理25或50個(gè)樣本。

Figure 1:  2D  analysis  of  whole  human  serum  before  (left)  and  after

(right) treatment with AlbminOUT^™.

產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 從樣本中不到10分鐘的時(shí)間內(nèi)去除白蛋白
• 基于白蛋白和Cibachron藍(lán)色染料的結(jié)合
• 每個(gè)柱子的結(jié)合力大于2mg的人白蛋白
• 從5-50微升人血漿中去除大于98%的白蛋白

去垢劑如SDS、Tween、Tritonde等是蛋白樣品處理過(guò)程中常用的組分。去污劑在蛋白提取和樣本制備過(guò)程中是很重要的物質(zhì)，特別是研究疏水蛋白時(shí)。蛋白樣本中高濃度去污劑的存在能夠影響ELISA,IEF和蛋白的蛋白酶消化，以及用質(zhì)譜進(jìn)行分析時(shí)抑制肽的離子化。

所謂請(qǐng)神容易送神難。要除掉這些去垢劑？G-Biosciences推出的DetergentOUT™ GB-S10去污劑去除柱子和樹(shù)脂專門(mén)設(shè)計(jì)用來(lái)除于蛋白或其他生物樣本中所含有的去污劑，樹(shù)脂能夠從蛋白水溶液和肽樣本中去除自由的，未結(jié)合的陰離子的，非離子或兩性離子的去污劑(e.g. SDS, Triton® X-100 或CHAPS)，同時(shí)對(duì)于下游進(jìn)行的質(zhì)譜或其他技術(shù)的分析應(yīng)用帶來(lái)zui小的樣本丟失。

DetergentOUT™ GB-S10柱子在第三方的研究使用中表明*兼容DI-QTOF和 LC-MS/MS（請(qǐng)見(jiàn)參考文獻(xiàn)）。DetergentOUT™ GB-S10柱子的使用顯著增加到了檢測(cè)到的肽光譜的數(shù)量。除此之外，DetergentOUT™ GB-S10柱子對(duì)于去污劑有高度的結(jié)合容量，比如每毫升固定的樹(shù)脂可以結(jié)合6mg SDS和14mg Triton® X-100。

Table 1:  A comparison of the detergent removal rates and percentage protein recovery with DetergentOUT^™ GBS10.

Tag蛋白的純化

帶有融合標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物----融合蛋白的純化通常也是緊接細(xì)胞破碎工作進(jìn)行的。設(shè)計(jì)融合標(biāo)簽的主要目的之一就是為了方便后繼的親和純化。目前zui為流行的融合標(biāo)簽自然是His-Tag，和GST，來(lái)自G-Biosciences等公司都有質(zhì)量非常穩(wěn)定可靠的產(chǎn)品，種類還特別豐富，分別對(duì)應(yīng)不同的上樣量和工作壓力和流速的需要。筆者在這里介紹一下江湖中盛傳的Tag蛋白純化的“刀劍笑”，目的就是為在產(chǎn)品選擇上幫你省點(diǎn)事......

“橫刀”-蛋白親和純化GST樹(shù)脂

G-Biosciences的谷胱甘肽樹(shù)脂，用于分離GST重組蛋白

用來(lái)親和純化帶有GST標(biāo)簽的蛋白。樹(shù)脂由還原性的谷胱甘肽通過(guò)10個(gè)碳原子的間隔臂共價(jià)偶聯(lián)到4%交聯(lián)的瓊脂糖上組成。每毫升樹(shù)脂可以結(jié)合大約8mg GST標(biāo)簽蛋白。樹(shù)脂浸在20%的乙醇中。谷胱甘肽樹(shù)脂有單獨(dú)的樹(shù)脂也有試劑盒形式提供。除了用于洗脫的還原性谷胱甘肽之外，結(jié)合/沖洗和洗脫緩沖液也有提供。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 用于純化GST蛋白
• 高載量，8mg/ml
• 配基密度，7-15μmoles 谷胱甘肽/ml
• 樹(shù)脂尺寸，50-160μm
• 樹(shù)脂結(jié)構(gòu)，4%交聯(lián)的瓊脂糖
• 10個(gè)碳原子的間隔臂

“名劍”-蛋白親和純化鎳螯合樹(shù)脂

用于分離6XHis標(biāo)簽重組蛋白，高度結(jié)合效率和低的非特異性結(jié)合。

固定的金屬親和層析樹(shù)脂（IMAC）使用鎳離子來(lái)純化6XHis標(biāo)簽蛋白。樹(shù)脂可以結(jié)合6X組氨酸殘基（6XHis），一種在蛋白純化中非常常用的標(biāo)簽。樹(shù)脂由氨基二乙酸偶聯(lián)到6%交聯(lián)的瓊脂糖上組成。氨基二乙酸可以共價(jià)結(jié)合到鎳離子上，每毫升樹(shù)脂可以結(jié)合20-40μmoles鎳離子。

這種鎳螯合樹(shù)脂有單獨(dú)的樹(shù)脂也有離心柱形式供選擇。

特定的結(jié)合和洗脫緩沖液液可以提供，

100ml His結(jié)合/沖洗緩沖液

(10mM Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

100ml His洗脫緩沖液

(0.25M Imidazole, 0.3M NaCl, 0.05M sodium phosphate (pH8.0))

產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 用于純化6XHis標(biāo)簽蛋白
• 高載量，大于50mg/ml
• 配基密度，每毫升樹(shù)脂結(jié)合20-40μmoles鎳離子
• 樹(shù)脂結(jié)構(gòu)，6%交聯(lián)的瓊脂糖

“笑三少”-鈣調(diào)蛋白樹(shù)脂

鈣調(diào)蛋白樹(shù)脂用于親和純化鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白（CBP），包括帶有CBP標(biāo)簽的重組蛋白和真核生物中鈣調(diào)蛋白調(diào)控的蛋白。樹(shù)脂是4%的瓊脂糖偶聯(lián)到鈣調(diào)蛋白上，配基的密度是1ml樹(shù)脂大約是1mg鈣調(diào)蛋白。

鈣調(diào)蛋白樹(shù)脂有單獨(dú)的樹(shù)脂產(chǎn)品形式以及試劑盒形式，試劑盒包括：

5ml樹(shù)脂，

100ml鈣調(diào)蛋白結(jié)合/漂洗緩沖液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM CaCl2)

100ml鈣調(diào)蛋白洗脫緩沖液，

(50mM Tris-HCl (pH7.5), 200mM NaCl, 2mM EGTA)

5個(gè)1ml離心空柱

5個(gè)空的小于5ml的重力流柱

緩沖液同時(shí)也可以單獨(dú)提供。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

• 用于純化鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白
• 結(jié)合CBP標(biāo)簽的重組蛋白
• 高載量，~1-3mg/ml
• 樹(shù)脂尺寸，50-160μm
• 樹(shù)脂結(jié)構(gòu)，4%高度交聯(lián)的瓊脂糖
• 配基密度，0.9-1.2mg 鈣調(diào)蛋白/ml 樹(shù)脂